Diplomato al Liceo classico Gaio Lucilio di Roma nel 1973 è sposato con Mariarita Bartolacci e ha un figlio di nome Luca nato a Houston il 21 febbraio 1992. Nel 1978 si laurea con lode in Fisica presso l'Università La Sapienza di Roma. Subito dopo la laurea negli anni 1979-1980 ottiene una borsa di studio dei plasmi termonucleari presso il Comitato nazionale per l'energia nucleare (Cnen) di Frascati.

Nel 1983 come ricercatore della Divisione energia solare dell'Ente nazionale energie alternative (Enea), si occupa di studi sulle caratteristiche elettroniche e sulla risposta spettrale delle celle fotovoltaiche. Nel 1984 diventa ricercatore presso l'Istituto di Fisica dello spazio interplanetario (Ifsi) di Frascati: è un laboratorio del Consiglio nazionale delle ricerche (Cnr) che svolge prevalentemente attività spaziale. Il suo ruolo è di co-investigatore all'interno degli esperimenti scientifici del Tethered Satellite System (Tss). Tra il 1985 e il 1988 organizza attività di sviluppo ed integrazione dell'esperimento Rete, realizzando tra l'altro il Ground Support Equipment, utilizzato per i test di laboratorio. Contemporaneamente collabora alla messa a punto di una camera di plasma per simulare in laboratorio i fenomeni elettrodinamici connessi con il Tss. In tale ambito si occupa dello sviluppo dei plasma contactors per applicazioni spaziali.

Nel 1989 diventa responsabile scientifico (Project Scienstist) di Rete. In questa veste organizza i test di integrazione con il satellite Tethered e si interessa alla pianificazione delle operazioni di volo. Nel 1990 è selezionato dall'Asi e dalla Nasa come uno dei due candidati Payload Specialist (Ps) per la prima missione del satellite Tethered. Si trasferisce presso il Centro astronauti del Johnson Space Center di Houston. Qui inizia l'addestramento per la missione. Nel 1992 completa l'addestramento come Alternate Payload Specialist (Aps) ed entra nel team di scienziati che controlla da terra le operazioni scientifiche della missione Tss-1 e cura in particolare i collegamenti con i membri dell'equipaggio impegnati nelle operazioni a bordo della navetta Atlantis.

Nel 1994 diventa membro dell'equipaggio della missione Sts-75 con due incarichi scientifici: il satellite Tethered (TSS-1R) al suo secondo volo, sviluppato congiuntamente dall'Asi e dalla Nasa e un complesso esperimento di microgravità al suo terzo volo.

Un anno dopo Umberto Guidoni effettua il suo primo volo nello spazio a bordo della navetta Columbia. La sua attività in orbita è prevalentemente rivolta ad esperimenti elettrodinamici del satellite Tss. Tramite queste prove dimostra per la prima volta la generazione di potenza elettrica nello spazio.

Lo Space Shuttle Columbia viene lanciato il 22 febbraio 1996 e atterra al Kennedy Space Center il 9 marzo 1996. Completa 252 orbite e percorre 6.5 milioni di miglia in 377 ore e 40 minuti.

Nell'agosto 1996 Guidoni comincia un nuovo addestramento della durata di due anni. E' la preparazione per le operazioni a bordo dello Space Shuttle e della futura International Space Station (Iss). Nell'aprile 1998, dopo aver completato l'addestramento diventa il primo astronauta italiano a conseguire la qualifica di Mission Specialist: astronauta professionista. Questa qualifica gli permette di volare a bordo della Stazione Spaziale assemblata in orbita a partire dal 1999.

Il 19 aprile 2001 parte da Cape Canaveral a bordo della navetta Endeavour insieme ad altri sei astronauti. E' il primo europeo, ad abitare la "casa comune" in orbita. La missione dura 11 giorni prevede il trasporto e l'installazione del componente più grande di un avanzato sistema robotico canadese: un braccio automatico lungo quasi 18 metri, di un valore di 900 milioni di dollari, che rappresenta il contributo canadese al laboratorio internazionale orbitante.

Lamberto Dini ha detto di lui: "Sono veramente orgoglioso".